Esha Flora Tissue Culture

 

INISIASI TANAMAN

Karantina indukan, Sterilisasi tanaman, dan Penanaman eksplan

(ESHA FLORA X IAAS IPB)

 

 

Inisiasi merupakan teknik mendapatkan kultur steril dengan mengambil kultur eksplan tanaman yang melewati berbagai proses sterilisasi.  Umumnya tahap inisiasi mengambil dari mata tunas tanaman. Sterilisasi eksplan, yaitu proses menghilangkan mikroba (bakteri, jamur) dari tanaman. Prinsip sterilisasi harus mendapatkan tanaman yang steril, dosis yang tepat agar tanaman hidup dan mikroba mati. Tahapan tersulit dari proses inisiasi ini adalah sterilisasi eksplan karena setiap tanaman mengandung mikroba terutama tanaman yang akan dikulturkan tumbuh di daerah tropis. Umumnya persentase keberhasilan dari proses inisiasi berkisar 10%.

 

Adapun tahapan dari inisiasi ialah sebagai berikut ;

1. Karantina indukan

2. Sterilisasi eksplan pra laminar

3. Sterilisasi di Laminar

4. Penanaman

 

1. Karantina Indukan

Karantina indukan dilakukan untuk mengeliminir adanya mikroba endofit, menyuburkan daya tahan tanaman indukan, serta mempercepat pertumbuhan sel. Tindakan yang perlu dilakukan pada tahap ini di antara lain :

1. Pemberian ZPT atau hormon seperti auksin, sitokinin, maupun giberelin.
2. Pemberian fungisida dan bakterisida, seperti benlox (fungisida) dan agrept (bakterisida).
3. Pemberian pupuk anorganik seperti gandasil, growmore, dan pupuk NPK lainnya. Jika tanaman diberikan pupuk organik khawatir akan memperbanyak bakteri endofit sehingga digunakan pupuk anorganik untuk memperkuat kondisi indukan.

 

2. Sterilisasi pra laminar

-          Potong-potong eksplan, bagian daun dibersihkan pakai alkohol 70%

-          Aliri air mengalir selama 15–30 menit untuk mengeluarkan fenol dari tanaman dan juga menghilangkan mikroba yang masih terdapat di eksplan tanaman.

-          Kocok dengan larutan fungisida 0.2 gram dan bakterisida 0.2 gram dalam 100 ml selama 30–60 menit. Tanaman kehutanan membuttuhkan larutan fungisida dan bakterisida yang lebih banyak, yakni umumnya 2 gram dalam 100 ml selama 1 jam.

-          Bilas hingga bersih

-          Rendam dengan larutan antibiotik (Streptomycin) 10 ml dalam 90 ml air steril, lalu di aerator selama 1 jam hingga 16 jam. Aerator yang digunakan di Esha Flora dimodifikasi, aerator dimasukkan ke dalam wadah yang ditutup dengan Hepa filter . Hepa merupakan filter dari laminar yang fungsinya untuk menyaring mikroba sehingga angin atau udara yang masuk bersifat steril.

 

3. Sterilisasi di Laminar

-          Tanaman dibilas air steril

-          Eksplan direndam, kemudian dikocok dalam larutan clorox atau bayclin 15% (7 menit)

-          Perendaman kembali dengan konsentrasi 5% selama 7 menit, dilakukan bertahap agar mengurangi terjadinya kontaminasi dan menghindari terjadi kerusakan jaringan tanaman yang penting.

-          Bilas dengan air steril selama 5 menit

-          Jika tingkat kontaminasi tinggi bisa menggunakan HgCl 10mg/100ml (3-10 meneit). Eksplan yang digunakan pada bagian pucuk muda direndam selama 3 menit sedangkan eksplan yang digunakan pada bagian pucuk tua perendaman bisa mencapai 7 menit .

-          Eksplan dibilas 3 kali dengan air steril masing-masing 5 menit. Harapannya eksplan tanaman benar-benar dalam kondisi steril.

-          Siap ditanam

 

4. Penanaman

Perbedaan penanaman di enkas dan di laminar

-          Enkas : Tidak perlu bunsen dan punya ruang gerak lebih terbatas dibanding laminar, serta ruangan tertutup dan sudah disterilisasi menggunakan alkohol sehingga kemungkinan eksplan terkontaminasi oleh mikroba lebih kecil. Sterilisasi menggunakan alkohol dan air steril yang dicampur dengan betadine.

-          Laminar: Lebih bebas bergerak, dapat menggunakan bunsen untuk pensterilan alat. Selain untuk pensterilan alat bunsen juga digunakan untuk sterilisasi biji anggrek karena inisiasi biji anggrek harus dibakar di dalam laminar. Selain itu, di  laminar juga mempunyai lampu UV yang berguna untuk sterilisasi (membunuh mikroba).

 

 

Proses pengambilan eksplan tanaman

Janda Bolong (Monstera adansonii) dan Puring (Codiaeum variegatum)

 

A.      Sterilisasi luar (sebelum sterilisasi di dalam laminar)

Alat :

1. Gelas ukur
2. Saringan
3. Talenan,
4. Scalpel untuk memotong tanaman.
5. Tisu

Bahan :

1. Air pureit
2. Spray isi alkohol,
3. Fungisida dan bakterisida (masing-masing 0,1 gr + 100 ml air)
4. Deterjen (1 gr larut 100 ml air)
5. Antibiotik yaitu streptomycin (10 ml)

 

Langkah Kerja:

1. Sayat dan ambil batang bertunas Janda bolong, pangkal batang yang berwarna cokelat dan hitam dibersihkan.
2. Untuk tanaman Puring yang diambil ialah daunnya. daun dipotong menjadi bagian-bagian kecil.
3. Kedua eksplan disemprot terlebih dahulu dengan alkohol 70% untuk dibersihkan, kemudian usap menggunakan tisu.
4. Dibersihkan kembali menggunakan air mengalir selama 30 menit
5. Dengan menggunakan pinset, eksplan dimasukkan ke dalam botol berisi deterjen, kemudian botol digoyangkan selama 10 menit.
6. Buang air deterjen, lalu bilas eksplan menggunakan air pureit hingga benar-benar bersih
7. Masukkan eksplan ke dalam botol bakterisida, dan goyangkan botol selama 30 menit
8. Bilas dengan air pureit hingga bersih
9. Kemudian masukkan kembali eksplan ke dalam botol fungisida, dan goyangkan botol selama 30 menit
10. Bilas dengan air pureit hingga bersih
11. Eksplan diberi antibiotik (streptomycin) 10 ml
12. Terakhir dalam proses sterilisiasi luar yakni proses aerator selama 1 jam, proses aerator adalah proses pemberian oksigen kepada tanaman, jika eksplan kurang bersih maka akan muncul busa disekitar eksplan.

 

B.     Sterilisasi dalam laminar

Alat :

1. Tiga botol selai (alkohol + betadine, air steril, dan wadah sampah)
2. Bunsen
3. Cawan petri
4. Pinset
5. Scalpel
6. Tisu steril

 

Bahan :

1. Eksplan tanaman
2. Alkohol
3. Betadine
4. Media tanam
5. Air steril

 

Langkah Kerja :

1. Menyemprot tangan menggunakan alkohol 70% agar tetap steril.
2. Menyiapkan 2 botol selai yang berisi air steril, kemudian memasukkan eksplan ke dalam botol 1 berisi air steril dan dikocok sebanyak 2 kali pengulangan pada botol yang berbeda selama 3 menit. Pengambilan eksplan menggunakan pinset.
3. Menyiapkan larutan HgCl2 10% (10 ml HgCl dicampur dengan 90 ml air steril) yang juga diteteskan tween sebanyak 3 tetes, kemudian eksplan yang sudah disterilkan direndam dan dikocok pada larutan HgCl2 selama 7 menit.
4. Memasukkan eksplan ke dalam air steril, kemudian dikocok selama 5 menit. Proses ini dilakukan sebanyak 2 kali pengulangan pada botol yang berbeda.
5. Memasukkan eksplan ke larutan Clorox 15% atau Bayclin (15 ml Clorox + 85 ml air) kemudian digoyangkan selama 7 menit. Perhatikan kondisi tanamannya apabila sudah memutih kurangi lagi SOP waktunya.
6. Memasukkan eksplan ke dalam air steril, kemudian dikocok selama 5 menit. Proses ini dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan pada botol yang berbeda.

 

Langkah Kerja Penanaman :

1. Menyiapkan cawan petri dan menyalakan bunsen menggunakan korek.
2. Memasukkan eksplan ke dalam air steril, kemudian dikocok selama 5 menit. Proses ini dilakukan sebanyak 2 kali pengulangan pada botol yang berbeda.
3. Cawan petri diberikan betadine dan alkohol 70% kemudian digoyang-goyangkan sampai betadinenya merata (bisa digoyangkan dalam posisi terbalik).
4. Cawan petri dibersihkan menggunakan tisu steril, kemudian cawan petri dibakar menggunakan bunsen.
5. Memasukkan tisu steril ke dalam cawan petri, tisu ini akan digunakan sebagai tempat atau wadah eksplan. Kondisi cawan petri diusahakan harus selalu dalam kondisi tertutup. 
6. Membakar ujung pinset menggunakan bunsen setiap akan digunakan, kemudian pinset tersebut dimasukkan ke larutan betadine. Apabila terdapat bagian ujung eksplan tanaman berwarna putih, maka harus dilakukan pemotongan.

7. Menyiapkan media tanam, air yang ada di media dibuang, kemudian mulut botol  dibakar dengan bunsen dan bagian ujung pinset jangan menyentuh mulut botol atau media tanamnya.
8. Memasukkan eksplan ke dalam media menggunakan pinset, posisi pinset miring, dan posisi tunas Janda bolong menghadap ke atas (tunas di atas) sedangkan eksplan Puring ditanam dengan posisi daunnya langsung ditancapkan atau tulang daunnya yang ditancapkan ke media tanam.

 

+ Proses Wrapping eksplan yang sudah ditanam pada media

Sebelum eksplan dimasukkan pada ruang inkubasi, botol eksplan dibungkus terlebih dahulu dengan plastik wrapping ;

-          Botol selai : hanya dengan membungkus pinggiran tutup botol dengan plastik wrap

-          Botol asi : setelah dikencangkan dengan karet, tutup botol harus menggunakan aluminium foil baru kemudian dibungkus dengan plastik wrap

 

+ Proses pelabelan botol eksplan

Botol eksplan yang siap dimasukkan ke dalam ruangan inkubasi terlebih dahulu diberi label. Adapun ketentuan pelabelan ialah dengan mencantumkan nama tanaman, tanggal inisiasi, media serta eksplan yang digunakan.

 

  

MEDIA KULTUR JARINGAN

(ESHA FLORA X IAAS IPB)

 

 

 

Kultur jaringan merupakan salah satu metode dalam pembibitan suatu tanaman yang menciptakan hasil steril dan tentunya hasil yang memuaskan. Kebutuhan dari tanaman itu sendiri terbagi menjadi 2, yaitu kebutuhan dari lingkungan dan kebutuhan media tanam. Kebutuhan lingkungan ini termasuk sinar, Karbondioksida (CO2), Oksigen (O2), kelembaban, sirkulasi udara, dan lain sejenisnya. Sementara itu, kebutuhan media tanam meliputi fisik tempat tumbuh dan zat kimiawi makanan.

Dalam penyiapan media yang optimal tentunya juga memerlukan bahan-bahan khusus agar hasil tanaman yang didapat nantinya dapat tumbuh secara maksimal. Sayangnya, bahan pro analis untuk pembuatan media tanam ini tergolong cukup mahal, seperti contoh sukrosa untuk sumber energi tanaman berharga ratusan ribu. Akan tetapi, beruntung bahan-bahan pro analis ini dapat digantikan oleh bahan teknis/alternatif. Seperti contoh sukrosa tadi dapat diganti dengan gula pasir putih dengan harga belasan ribu saja. Tentu hasil yang didapat dari bahan teknis ini juga tidak kalah dari hasil yang didapat dari bahan pro analis.

Bahan-bahan yang dapat digantikan ini cukup banyak dari sumber energi untuk tanaman kultur jaringan yaitu sukrosa dapat digantikan dengan gula pasir putih. Bahan pemadat dari agar bacto dapat digantikan dengan agar swallow atau agar batangan. Vitamin B1, B6, B12, dan lainnya dapat digantikan dengan vitamin B Kompleks yang ada di pasaran. Arang aktif yang dapat diganti norit. Lalu bahkan sampai antibiotik yang biasanya memakai streptomisin dapat diganti dengan agrept (bakterisida) atau amoksisilin tablet yang biasanya kita konsumsi saat sakit. Tentunya bahan yang digunakan harus melalui proses penumbukan dan penyaringan terlebih dahulu agar hasil yang didapat lebih murni. Ada juga ZPT yaitu zat pengatur tumbuh yang bahan pro analisnya dapat kita ganti juga dengan bahan teknis/alternatif.

 

1. Proses pembuatan media kultur jaringan

Bahan-bahan :

1. Growmore sbg unsur hara
2. Vitamin
3. Asam amino (glycine, pepton)
4. Sumber energi (gula pasir)
5. Bahan pemadat (agar-agar swallow)
6. Air steril / akuades
7. Myo-Inositol

 

Alat-alat :

1. Pipet plastik
2. Pengaduk kaca
3. Timbangan digital
4. Gelas ukur
5. Panci stainless steel
6. Alat pengukur pH (kertas lakmus)
7. kompor

 

            Langkah Kerja :

 

●       Pembuatan Media

1. Timbang Growmore (2 gr/L) menggunakan timbangan digital
2. Growmore yang telah ditimbang dimasukkan ke dalam cerek plastik berisi 500 mL air, kemudian aduk denganpengaduk kaca
3. Campurkan vitamin (5 mg/L) ke dalam cerek, menggunakan pipet plastik 3 mL
4. Campurkan asam amino yakni glycine ke dalam cerek, sebanyak 2 mg/L dari perbandingan 1:1
5. Timbang pepton 100-200 mg/L atau setara dengan 0,2 g/L, dan larutkan dengan sedikit air sebelum mencampurkannya ke dalam cerek. Setelah larut, campurkan ke dalam cerek lalu aduk
6. Timbang myo-inositol sebanyak 0,1 g/L, kemudian campurkan ke dalam cerek dan aduk
7. Campurkan sumber energi yaitu gula pasir sebanyak 30 g/L, jika ada tambahan air kelapa maka takaran gula pasir menjadi 20 g/L. Lalu masukkan ke dalam cerek dan aduk hingga larut
8. Tambahkan air ke dalam cerek hingga genap 1 Liter, lalu aduk kembali.
9. Kemudian cek kadar pH larutan dalam cerek, menggunakan kertas lakmus pH
10. Normal pH yang akan dihasilkan oleh larutan ialah 5.8 hingga 6. Jika larutan terlalu basa maka diturunkan dengan HCl, dan jika terlalu asam maka dinaikkan dengan NaOH.
11. Masukkan zat pemadat yakni agar-agar yang telah ditimbang sebanyak 6 gr/L, ke dalam panci stainless steel
12. Masukkan juga larutan yang telah diracik dalam cerek ke dalam panci, lalu aduk.
13. Nyalakan api kompor dan masak larutan media hingga mendidih sambil diaduk terus menerus
14. Setelah mendidih, matikan api kompor

 

●       Sterilisasi Media

Bahan-bahan :

1. Larutan media yang telah selesai dibuat

 

Alat-alat :

1. Beberapa jenis botol
2. Plastik PP ukuran 10x10
3. Gelang karet
4. Autoklaf
5. Dendeng
6. Kompor

 

 

Langkah sterilisasi:

1. Siapkan beberapa jenis botol yang telah disterilisasi selama 1 jam
2. Tuang larutan media ke dalam botol dengan takaran 20 ml/L atau sekitar 2 cm untuk tiap botolnya. Antara mulut bolot dan cerek usahakan tidak saling bersentuhan karena botol telah steril.
3. Tutup mulut botol dengan plastik PP dan eratkan dengan gelang karet. Menutup botol tidak boleh terlalu kencang agar menghindari kerusakan saat botol disterilisasi kembali pada suhu tinggi (121).
4. Botol-botol yang telah terisi larutan media disusun di dalam dandang untuk disterilisasi
5. Siapkan Autoklaf  dan isi air hingga batas yang tertera di dinding autoklaf
6. Masukkan dendeng yang berisi botol-botol media ke dalam autoklaf, lalu tutup rapat penutup autoklaf.
7. Pastikan tombol safety pada autoklaf dalam posisi tertidur dan katup uap dalam posisi berdiri, karena bila katup tertutup, uap dari proses sterilisasi akan terkurung
8. Nyalakan api besar hingga proses pemanasan pada autoklaf mencapai suhu 121 dengan tekanan 17,5 Psi
9. Kecilkan api kompor ketika suhu telah sesuai dan autoklaf menghasilkan banyak uap, dan diamkan selama 30 menit.

 

●       Proses Pengencangan Tutup untuk Media

1. Mengencangkan tutup plastik di bagian leher botol menggunakan satu ikatan karet yang sama dengan sebelumnya, tetapi diikat lagi beberapa kali agar lebih kencang dan rapat
2. Menarik plastik agar tidak ada lagi lekukan atau lipatan, apabila lekukan tersebut tidak dirapikan media tersebut akan mudah terkontaminasi karena udara akan masuk.
3. Mengikat kembali dengan satu karet hingga kencang apabila plastik sudah rapi.
4. Memasukkan botol ke dalam plastik media berukuran 40 x 60 cm, tetapi sebelum dimasukkan plastik tersebut disterilkan atau disemprot menggunakan alkohol 30%.
5. Menyusun botol kultur (botol asi) dengan susunan 6 x 8, satu liter dapat menampung 50 botol asi dan 24 botol selai.
6. Media sudah siap digunakan setelah lima hingga tujuh hari ke depan setelah proses sterilisasi dan pemadatan media. Media tidak dapat digunakan langsung karena belum bisa melihat kontaminasi dari bakteri ataupun jamur sebab media yang terkontaminasi tidak dapat digunakan.

 

     B. Pencucian dan Sterilisasi botol

Alat :

1. Wadah plastik berukuran sedang
2. Botol kultur habis pakai atau media yang telah terkontaminasi
3. Sikat

 

Bahan :

1. Air
2. Detergen
3. Bayclin

 

Langkah Kerja :

1. Membersihkan botol dari media tanam yang terkontaminasi oleh mikroorganisme atau telah digunakan untuk proses pengkulturan.
2. Menuangkan satu tutup botol bayclin ke dalam wadah yang berisikan air.
3. Menuangkan detergen secukupnya ke dalam wadah yang berisikan air dan bayclin hingga berbusa. 
4. Merendam botol-botol kultur yang telah dibersihkan dari media tanam selama 30 menit hingga 1 jam .
5. Menyikat bagian dasar dan sisi botol setelah 1 jam perendaman, hal ini dilakukan agar sisa-sisa media tanam yang terkontaminasi di dalam botol dapat dibersihkan dengan maksimal.
6. Membersihkan bagian sisi luar botol menggunakan spons atau kain untuk cuci gelas atau piring.
7. Botol yang telah disikat dan dibersihkan bagian luarnya kemudian dibilas di air mengalir hingga bersih. 
8. Botol yang sudah dicuci kemudian dilakukan sterilisasi menggunakan autoklaf selama 1 jam dengan suhu 121

 

 

SUB KULTUR: BERBAGAI TEKNIK KULJAR

(ESHA FLORA X IAAS IPB)

 

 

 

 

Sub kultur dan Esha Flora

 

Kultur jaringan merupakan ilmu yang tidak terlepas dari langkah-langkah yang dikerjakan secara teliti. Langkah-langkah yang dimaksud memiliki banyak sekali tahapan dan secara umum disebut sebagai metode sub kultur. Adanya kegiatan tersebut berfungsi menghasilkan bibit unggulan dan sebagai media penyelamatan tanaman yang terancam punah. Namun demikian, ada banyak sekali evaluasi yang perlu diperhatikan agar menghasilkan produk yang unggulan. Di Esha Flora sendiri, tingkat keberhasilan sub kultur mencapai 80%-100% hal menunjukan persentase yang lebih besar dibanding proses inisiasi. Meskipun demikian, ada beberapa ragam tujuan dari sub kultur, di antaranya untuk penjarangan, peremajaan, perbanyakan/multiplikasi, pembesaran/pengakaran, dan penyelamatan.

 

Macam-macam cara sub kultur

 

1. Penjarangan

Penjarangan adalah kegiatan menurunkan jumlah individu pada suatu populasi akibat pertumbuhan untuk menghindari persaingan kebutuhan faktor lingkungan. Biasanya kegiatan ini dilakukan pada kultur semai biji yang dijarangkan sebanyak 3-4 kali sub kultur agar tanaman dapat tumbuh dengan baik. Adapun langkah dari kegiatan penjarangan, diantaranya:

1.      Eksplan dikeluarkan dari botol yang telah disemprot oleh alkohol 70%, kemudian letakkan eksplan pada cawan petri.

2.      Pisahkan eksplan dengan pinset dan scalpel yang telah digarang.

3.      Cabut akar browning dan potong daun eksplan agar pertumbuhannya seragam.

4.      Pada sub kultur yang telah ditumbuhi selama 3 bulan, plb (protocorm-like-bodies) siap dikeluarkan dengan spatula yang telah digarang.

5.      Eksplan dapat ditanam pada media pertumbuhan.

B.  Peremajaan

Peremajaan adalah kegiatan sub kultur yang bertujuan meremajakan sifat kultur yang akan dihasilkan. Peremajaan dilakukan apabila ada daun yang mengalami browning dan dapat dilakukan juga apabila media kultur mengering. Peremajaan dapat dilakukan melalui cara pemindahan eksplan ke dalam media kultur yang baru.

 C.   Perbanyakan atau Multiplikasi

1.      Tanaman selama proses inisiasi sudah steril dan mengalami pertumbuhan dengan kriteria bisa diperbanyak seperti sudah tumbuh dua ruas atau tiga ruas sehingga bisa segera dikultur

2.      Tanaman bisa dipotong-potong dan dipindahkan ke media perbanyakan atau multiplikasi untuk menumbuhkan tunas atau anakan yang banyak.

3.      Perbanyakan perlu dilakukan pada tanaman yang menghasilkan kultur steril. Pada tanaman tertentu seperti anggrek macodes perlu di sub kultur secara vertikal.

4.      Pada kegiatan perbanyakan ini media tanam dapat digunakan hormon yang sedikit agar tanaman tidak cepat tumbuh

     

       D. Pembesaran atau Pengakaran

Tanaman hasil multifikasi ukurannya kecil tapi jumlahnya banyak apabila ingin tanaman tumbuh besar untuk siap diaklimatisasi harus dipindahkan ke media pembesaran yaitu media yang tanpa diberi hormon atau diberi hormon dengan konsentrasi rendah, dapat menggunakan BAP dengan konsentrasi rendah atau menggunakan MS saja, ataupun jika menggunakan ZPT dapat digunakan dalam dosis rendah sehingga tanaman bisa tumbuh seperti semula dan tumbuh akarnya. Tanaman bisa dipotong-potong berdasarkan luasnya atau anaknya dipisah-pisah jika sudah tumbuh individunya. Apabila setelah di media pembesaran eksplannya sudah besar dan berakar, pada media MS0 maka tidak perlu dipindahkan ke media perakaran. Bila tanaman masih belum berakar maka pindahkan dulu ke media untuk pengakaran sebelum diaklimatisasi. Contoh pada tanaman cendana jika tidak diinduksi menggunakan ZPT maka perakaran tidak akan tumbuh. Adanya kegiatan perakaran bertujuan untuk membentuk akar sehingga tanaman bisa diaklimatisasi.

 

       E. Penyelamatan

Penyelamatan dilakukan jika terdapat jamur (berbentuk serabut atau kapas berwarna) ataupun terdapat bakteri (lendir dan berwarna putih) pada media maupun pada eksplan terkontaminasi. Dikeluarkan dan dipotong eksplan yang tidak terkontaminasi kemudian disterilisasi dengan clorox 5% selama 7 menit. Kemudian eksplan ditanam pada media baru. Tidak semua penyelamatan menggunakan clorox 5%, jika tanaman terlalu kecil atau rentan bahan kimia maka bisa menggunakan antibiotik dan ini tergantung jenis kontaminasi. Pada kontaminasi jamur menggunakan antibiotik nistatin. Pada kontaminasi bakteri menggunakan streptomisin ataupun amoxilin, dan kedua jenis antibiotik ini perlu digerus dan diberi air kemudian disaring airnya, dan digunakan untuk sterilisasi dengan dikocok lalu dibilas sehingga subkultur bisa di taman kembali.

 

 

Tahapan Sub Kultur (Penjarangan)

           

Sebelum enkas digunakan perlu disterilisasi dengan disemprot menggunakan alkohol hingga bersih diamkan selama 30 menit, dimasukkan alat-alat satu persatu dan disemprotkan oleh alkohol juga satu persatu lalu didiamkan selama 30 menit, alat-alat ditata dengan rapi. Subkultur yang digunakan adalah macodes.

 

Alat dan Bahan:

●       Tanaman Macodes

●       Media tanam dengan growmoro GP atau Glisin Pepton

●       Betadine

●       Air steril

●       Kapas steril dan tisu steril

●       Pinset dan scalpel

●       3 botol selai, satu untuk alkohol, satu untuk air steril yang ditetes dengan betadine, dan sisanya untuk sampah agar selama menanam sampah tidak berserakan di dalam enkas

 

Langkah Pengerjaan:

1. Membuat air steril dan ditambah betadine 5 - 7 tetes sampai warna kecoklatan atau seperti teh lalu terilisasi petridish menggunakan air steril ratakan air steril agar tercampur betadine dan sampai rata ke semua permukaan petridish. Selanjutnya air dibuang ke botol selai untuk sampah lalu dibilas menggunakan air steril. Dibilas sampai sisa betadine hilang dari petridish. 
2. Ambil kapas steril untuk mengelap petridish, ambil kapas menggunakan pinset, usahakan tangan tidak menyentuh petridish, dan Sampah kapas dibuang ke botol selai untuk sampah.
3. Enkas tidak menggunakan bunsen sehingga tuang air steril pada tutup selai dan beri betadin 3 tetes, kemudian ditambah dengan kapas steril untuk mengelap tutup botol.
4. Sebelum menanam di dalam petridish ditaruh tisu steril. Siapkan tanaman yang akan di sub kultur yaitu macodes. Pinset  dan scalpel dari botol selai berisi alkohol dicelupkan ke dalam air steril dan betadine.
5. Diambil tanaman menggunakan pinset, gunakan scalpel untuk memotong tanaman yang akan dikulturkan dan apabila telah selesai menggunakan scalpel ataupun pinset harus dicelup ke dalam air steril yang sudah diberikan betadine. Apabila tanaman yang sudah dikulturkan telah selesai diambil maka tutup kembali botol yang berisi tanaman sub kultur agar terjaga sterilisasinya.
6. Tanaman yang berwarna kecoklatan dibuang, potong menggunakan scapel dan jepit tanaman menggunakan pinset. Selama nanam jangan banyak berbicara karena dapat menyebabkan kontaminasi dan tangan tidak boleh keluar 
7. Tanaman yang akan disub kultur harus bersih dari media, setelah itu scapel dan telah digunakan dimasukkan ke dalam alkohol
8. Gunakan media grow more dan glisin pepton untuk media tanam. Gunakan botol selai atau dapat juga menggunakan botol asi. Botol selai ini diisi 5 - 8 tanaman tergantung besar tanaman yang dipotong.
9. Mulut botol dilap menggunakan kapas yang telah direndam dalam air steril dan betadine. Usahakan jari kita tidak menempel pada mulut botol. Untuk air betadine juga jangan sampai masuk ke dalam media.
10. Pada proses penanaman gunakan pinset lalu ambil satu potong sub kultur masukkan ke dalam botol selai yang sudah berisi media, Posisi saat menenam pinset dimiringkan agar lebih memudahkan untuk menanam. Usahakan pinset tidak terkena media tanam
11. Setelah menanam mulut botol dilap lagi dengan air steril dan betadine dan jangan sampai menetes ke dalam media, lalu ditutup hingga benar-benar rapa, jika tidak dapat menyebabkan kontaminasi
12. Tutup botol selai, di wrapping lagi, sedangkan botol asi di gunakan aluminium foil lalu diikat dengan kuat dan ditutup lagi dengan wrap.
13. Beri label berisikan tanggal dan hari tanam, jenis tanaman, nama penanam dan jenis media yang digunakan. Satu bulan adalah minimal tanaman dikatakan berhasil atau tidak. Jika besok sudah kontaminasi maka menunjukkan cara kerja kita kurang baik mungkin alat-alatnya kurang diperhatikan atau saat bekerja berbicara.

 

 

 

 

 

 

 

 

  

Permasalahan dan Prospek kultur jaringan

(ESHA FLORA X IAAS IPB)

 

 

 

 

A. Permasalahan Teknis

1.     Kontaminasi

Kontaminasi yaitu suatu permasalahan sehari-hari dalam pengelolaan kultur jaringan. Kontaminasi menjadi masalah utama pada saat inisiasi. Kondisi tanaman dari luar hampir 100% pasti mengalami kontaminasi. Tidak hanya sterilisasi luar, tetapi kita juga harus sterilisasi dalam atau sterilisasi endofit tersebut. Ketersediaan antibiotik atau zat sistemik untuk dapat membunuh mikroba tersebut dalam spektrum luas menjadi sangat penting. Kelompok besar mikroba yang menyebabkan kontaminasi dan harus dibasmi, yakni bakteri gram negatif, positif. Dalam prakteknya kultur jaringan ini harus benar-benar steril agar hasil yang didapat maksimal.

 

2.     Browning (Pencoklatan)

Browning (pencoklatan) suatu permasalahan dalam kultur jaringan karena bahan eksplannya bersifat dewasa atau tua yang memang karakter jenisnya nantinya membuat karakter tumbuhan memunculkan warna coklat yang bersifat antiseptik atau memunculkan karakteristik yang menghasilkan senyawa metabolik (fenolik). Proses browning atau pencoklatan ini bukan dipengaruhi oleh faktor luar, melainkan pengaruh faktor fisiologi dan karakter genetik tanaman. Cara mengatasi masalah ini, yakni dengan pemilihan bahan eksplan yang masih muda, indukan yang masih muda juga, eksplan yang diambil menggunakan jaringan meristem karena masih aktif membelah. Penanggulangannya yang dapat dilakukan apabila planlet sudah mengalami browning, yaitu pemberian zat antioksidan berupa vitamin c atau zat yang mampu menghambat proses oksidasi, melakukan penempatan lahan kultur di awal tahap inisiasi di tempat gelap, serta memberikan perlakuan dengan menempatkan di ruangan bersuhu dingin selama 2 minggu untuk memberikan kesempatan pada eksplan untuk sembuh tanpa melakukan metabolisme yang tinggi sehingga tidak memunculkan metabolisme sekunder yang mengakibatkan oksidasi.

 

3.        Viabilitas

Viabilitas yang menentukan adalah arah pertumbuhan dari hormon. Media yang umum digunakan adalah media Murashige Skoog (MS). Permasalahan viabilitas ini merupakan masalah yang biasa terjadi pada saat dilakukan perbanyakan. Namun, dengan proses belajar dan penelitian yang dilakukan secara terus-menerus, maka permasalahan ini menjadi semakin membaik. Penelitian viabilitas terhadap kemampuan tanaman untuk tumbuh di lingkungan tertentu dapat dilakukan dengan pendekatan pertama melalui jurnal dan kedua melalui percobaan kecenderungan sifat dari suatu tanaman dari hasil yang biasa sampai hasil yang ekstrim. Permasalahan viabilitas seringkali yang terjadi, yaitu tanaman tidak mati karena kebutuhan nutrisi pada media MS masih tercukupi, tetapi tidak tumbuh karena hormonnya kurang dan daya dorongnya kurang sehingga untuk menumbuhkan tunas dan organ diperlukan asupan hormon yang formulanya mengarahkan pada tujuan yang diinginkan.

 

4.        Aklimatisasi

Aklimatisasi adalah suatu tahap akhir untuk mengeluarkan planlet dari hasil kultur jaringan ke lahan atau lapangan. Proses aklimatisasi, yaitu proses mengadaptasikan secara bertahap dari dalam botol sampai keluar di lingkungan. Proses ini baiknya ketika tanaman tumbuh dengan lengkap, proses pengadaptasian planlet dimulai dengan penggunaan hormon yang dikurangi sedikit demi sedikit hingga tidak diberikan hormon agar tanaman mampu menghasilkan hormon endogennya sendiri (normalisasi hormon). Proses hardening merupakan sebuah proses penguatan dinding sel planlet sehingga lebih tebal, kuat, dan tidak terdehidrasi.dan melatih untuk bermetabolisme tinggi. Proses hardening dilakukan dengan meletakkan tanaman kultur jaringan di ruang kaca atau green house. Pemberian sinar dan pergantian suhu membuat metabolisme tanaman menjadi tinggi. Pada kondisi ini tanaman tidak akan mati karena tanaman masih di dalam botol tertutup sehingga tanaman tidak mengalami dehidrasi (kekurangan air dan kelembaban), ketersediaan nutrisi dan makanan masih tersedia, tetapi walaupun nutrisi tanaman masih tersedia di dalam botol, tanaman sudah mulai beradaptasi di lingkungan luar. Upaya yang dapat dilakukan untuk mengadaptasikan tanaman hasil kultur jaringan ke lingkungan luar, yakni dilakukannya proses penyungkupan berlapis.

Proses penyungkupan berlapis terdiri dari tiga lapis, yakni lapisan rumah kaca yang tertutup oleh plastik UV atau  kaca, paranet untuk menjaga tanaman dari hujan, angin, dan suhu yang panas; sungkup di bedengan berupa paranet untuk mengurangi sinar dan angin, sungkup bak plastik untuk menjaga kelembaban tanaman. Pada proses ini plastik sungkup dibuka secara bertahap mulai dari sungkup yang paling dalam keluar, yakni sungkup plastik ke sungkup rumah kaca. Pembukaan sungkup dilakukan bertahap, misalnya pada minggu pertama dibiarkan sungkupnya agar kondisi tetap lembab, minggu kedua dibuka 1 jam pada pagi hari kemudian tutup lagi, minggu ketiga dibuka 1 jam pagi dan 1 jam sore selama seminggu, minggu keempat dua jam pagi dan dua jam sore, demikian seterusnya sampai sungkup plastik tersebut terbuka hingga 24 jam. Setelah dibuka sungkup plastik, kemudian sungkup paranet mulai dibuka.

 

5.        Variasi somaklonal

Variasi somaklonal yaitu suatu permasalahan teknis dimana mulai terlihat ketika bibit tanaman mulai dewasa dan mulai berbuah atau berbunga. Dimana hasilnya bervariasi seperti tinggi tidak berbunga, pendek berbunga, pendek tidak berbunga, dan lain-lain. Dengan adanya masalah ini, perbanyakan dari sel vegetatif yang seharusnya menghasilkan tanaman yang seragam dengan indukannya, tetapi juga ditemukan hasil tanaman yang berbeda dengan indukannya. Perbanyakan kultur jaringan harus memperhatikan aspek adanya variasi somaklonal ini, dengan demikian diperlukan dan dibuat SOP atau tata tertib dalam subkulturnya sehingga dihasilkan bibit tanaman yang seragam.

 

6.        Penurunan Kualitas Kultur

Penurunan kualitas kultur karena adanya proses perbanyakan yang terus berulang dalam proses subkultur. sehingga hasil yang didapat semakin menurun. Suatu variasi menyebabkan penurunan produktivitas.

 

B. Permasalahan Non-teknis

1.        Sumber Daya Manusia

Permasalahan terjadi ketika pengusaha agribisnis di bidang kultur jaringan yang tidak memahami kultur jaringan dan karyawan yang mengetahui proses-prose skultur jaringan keluar. Untuk menanggulangi hal ini, yakni dengan melakukan dokumentasi SOP atau mencatat hal yang sudah dilakukan oleh orang yang sebelumnya melakukan kegiatan kultur jaringan.

 

2.        Pasar

Pengusaha bingung terkait penjualan hasil produk kultur jaringan. padahal dalam kondisi sekarang pada kultur jaringan menjadi sangat penting dan dibutuhkan oleh banyak pihak baik dalam negeri dan luar negeri. Tetapi, karena tidak berada dalam arus tren menjadi bingung untuk memasarkannya. Esha flora menjadi tempat untuk konsultasi terkait informasi teknologi, bahan alat, dan metode yang dikembangkan. Esha flora menjadi sesuatu yang dibutuhkan untuk pihak lain.

 

3.      Manajemen

Manajemen ini menjadi sangat penting untuk mengelola SDM, koleksi kultur, mengevaluasi permasalahan, termasuk menemukan solusi-solusi terkait permasalahan-permasalahan yang muncul. Jika manajemen tidak baik maka evaluasi juga akan rendah sehingga nantinya tidak akan maksimal. Manajemen pembuatan database koleksi tanaman diperlukan karena sangat berguna untuk mengetahui kondisi tanaman yang ada du Esha Flora.

 

4.      Perencanaan & Program

Sangat sedikit sekali tenaga SDM yang dapat merencanakan dan memprogram kegiatan Kultur jaringan dalam pengelolaan, perencanaan dan program tersebut terkait tujuan seperti target yang diinginkan sehingga tujuan-tujuan tersebut dapat terlaksana dengan baik. Seperti contoh bagaimana cara produksi 1 juta bibit dalam setahun seperti pakai alat apa, pakai proses apa, dan lainnya sehingga dibutuhkan adanya Quality Control dan Quality Assurance untuk mengontrol program-program tersebut agar tidak melenceng dan dapat mengevaluasi kualitas dari proses kultur jaringan sesuai SOP yang telah ada. Dengan adanya hal tersebut, perusahaan dapat menjamin adanya jaminan mutu yang berkualitas terhadap produk yang dihasilkan.

 

5.      Evaluasi & pemecahan masalah

Para pengusaha kultur jaringan seringkali ditemui tidak mampu mengevaluasi dan melakukan proses pemecahan masalah. Jadi, evaluasi dan pemecahan masalah ini terkait dengan kompetensi kemampuan dalam mengatasi masalah secara teknis. Banyaknya tahapan dalam kultur jaringan menjadi dorongan bagi pengusaha kultur jaringan untuk mengamati berbagai hal dan masalah.

 

 

C. Permasalahan Agribisnis berbasiskan Kultur Jaringan

Kultur jaringan masih memiliki beberapa kendala dalam dunia agribisnis, terutama bila menyangkut dengan kebijakan pemerintah dalam program-programnya. Hal ini dapat disebabkan oleh beberapa permasalahan, seperti :

 

1. Ketersediaan bahan eksplan

2. Persiapan yang panjang untuk dapat menyuplai bibit

3. Kemampuan produksi jumlah besar dalam waktu yang singkat

 

Ketersediaan bahan eksplan bisa saja terbatas saat terjadi tren yang tinggi di masyarakat, hal berakibat pada kurangnya bahan, prosesnya kultur yang lama, inisiasi yang rendah, dan harga yang mahal. Adapun mempersiapkan kultur dalam waktu yang lama dapat memengaruhi jual beli, karena nantinya bisa saja tren di masyarakat sudah menurun. Kemampuan produksi jumlah besar dalam waktu singkat juga menjadi permaslahan, sehingga dibutuhkannya alat-alat kultur modern yang dapat mempermudah serta mempercepat multiplikasi.

 

 

D. Prospek Kultur Jaringan

            Prospek kultur jaringan memiliki manfaat yang sangat besar terhadap bidang pendidikan, penelitian, hingga bagaimana Indonesia mampu bersaing dengan negara-negara lain dalam menghasilkan bibit biodiversity yang unggul dan berkualitas tinggi. Berikut beberapa prospek kultur jaringan :

 

1. Persyaratan ekspor menggunakan bibit kultur jaringan

2. Kemampuan menghasilkan bibit jumlah besar, seragam dalam waktu relatif singkat, dan kontinu

3. Kemampuan menghasilkan bibit 100% unggul dan berkualitas

4. Kemampuan Menghasilkan varietas Unggul baru

5. Pemanfaatan yang sangat luas dan sangat penting

 

Persyaraatan ekspor ini memiliki prospek yang tinggi karena market dari kultur jaringan tidak hanya dari Indonesia saja tetapi juga luar negeri. Hal ini dikarenakan masih banyak negara yang membutuhkan bibit-bibit kultur jaringan terutama dari Indonesia karena beragamanya tanaman dari Indonesia.

 

E. Pemanfaatan Kultur Jaringan

1. Konservasi In Vitro (Bank Plasma Nutfah)

2. Penyelamatan Embrio (Embrio Rescue)

3. Membuat tanaman mini (kultur Anther)

4. Membuat tanaman bebas virus (Kultur Meristem)

5. Membuat tanaman tanpa biji (Kultur Kotiledon)

6. Menghasilkan bahan farmasi langsung dari dalam botol kultur (Metabolit Sekunder)

7. Menumbuhkan bunga dan penyerbukan di dalam botol kultur (Kultur organ)

8. Membuat mutasi variegata (Penggunaan zat mutasi dan radiasi sinar gamma)

9. Membuat tanaman raksasa (Poliploid)

10. Memunculkan keanekaragaman genetik (Variasi somaklonal)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

#eshaflora #kulturjaringan #planttissueculture #tissueculture #bogor #inisiasi #subkultur #pelatihankulturjaringan #aklimatisasi #mediakulturjaringan #hormon #pupuk #zpt #ipb #tanamankultur #skalarumahtangga #poc #anggrek #bisnis #wiraswasta #magang #pkl #penelitian